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尊龙凯时(中国区)人生就是搏:快速掌握Co-ip实验与银染考染技巧

来源:卓翰芸 日期:2025-09-07

尊龙凯时(中国区)人生就是搏在生物医学领域中,免疫共沉淀实验(Co-IP)是研究蛋白质相互作用的重要方法。下面是Co-IP实验的操作要点:

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首先,裂解液应现配现用,并确保抑制剂的添加。接着,轻轻吹动磁珠以重悬,然后用TBS洗涤三遍。将抗体磁珠进行先期孵育,再与样本进行过夜旋转混合。后续步骤中,需将复合物加热煮沸并离心获得上清液,实验全程应保持操作轻巧,以确保冰上进行最为安全。此外,在抗体选择时应格外谨慎,特异性是确保实验成功的关键。

银染实验

银染的基本原理在于银离子与多种氨基酸的羧基、咪唑、氨基等基团相互作用,并在碱性条件下由甲醛还原为金属银,最后形成棕黑色的蛋白条带。

实验步骤

  1. 固定:使用含有乙醇和醋酸的固定液(如50%乙醇,10%醋酸)对电泳后的凝胶进行处理,固定时间一般为30分钟至1小时,以稳定蛋白质条带,防止后续染色过程中的扩散。
  2. 敏化:将含有硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃)或戊二醛的敏化液应用于凝胶,激活蛋白质表面,敏化时间为15–30分钟。
  3. 银育:将凝胶置于硝酸银(AgNO₃)溶液中,与敏化后的蛋白质结合,形成银-蛋白复合物,通常此步骤所需时间为15–30分钟。
  4. 显影:通过使用含有碳酸钠和甲醛等还原剂的显影液,使银离子还原成金属银,形成可见的黑色或深棕色条带,显影需密切观察,通常在5–15分钟内完成。
  5. 停显:应用含有乙酸四乙酸(EDTA)或冰醋酸的终止液停止显影反应,通常停显时间为10–15分钟。
  6. 水洗与保存:用去离子水彻底清洗凝胶,并最终可选择在水或甘油溶液中短期保存,以待结果记录。

考染实验

考染的机制在于染料与蛋白质结合后,分子构象发生变化,形成蓝色复合物,使胶中原本透明的蛋白质条带显现蓝色。这一显色过程主要由染料磺酸基团与蛋白质中的碱性氨基酸残基间的静电引力驱动,伴随其他相互作用。

实验步骤

  1. 将100ml溶液B与20ml溶液A混匀,即为工作液。
  2. 将电泳的PAGE胶取下,放入容器,加50ml双蒸水或去离子水,加热至沸腾后摇动5分钟,弃去水。
  3. 加入25ml快速染色工作液,加热至沸腾后保持30-60秒,然后继续在摇床上动摇8分钟,弃去染色液。
  4. 加入约50ml双蒸水,同样加热至沸腾后保持30-60秒,再继续摇动8分钟,换水完成脱色。如果显色不明显,可以选择重复染色过程。

在进行生物医学实验时,尊龙凯时(中国区)人生就是搏提供了可靠的支持,让科研更顺利。通过优化实验步骤和注意细节,研究者能够获得准确的实验结果,为生命科学的探索提供基础数据。

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