免疫沉淀实验在生物医学研究中被广泛应用，尤其在探讨蛋白质相互作用及其表达状态方面具有重要意义。根据具体的实验需求，研究人员可以选择不同的免疫沉淀技术，主要包括磁珠免疫沉淀法与固定免疫沉淀法。

磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G的磁珠与特定抗体结合，从而有效捕获目标蛋白。这种方法的优势在于其操作简便、速度快，并且分离效率高，非常适合于高通量筛选及自动化实验。磁珠在使用磁性分离架进行快速分离时，不仅简化了实验步骤，还在研究蛋白质-蛋白质相互作用和信号传导途径方面提供了极大的便利。

固定免疫沉淀法则是通过固定化抗体（通常是偶联到珠子上的抗体）来捕获目标蛋白，此法通常用于蛋白质印迹法（Western Blot）前的样品准备。虽然这种方法需要较长的孵育时间以形成免疫复合物，但其提供的高特异性和灵敏度使其非常适合于对目标蛋白表达及修饰状态的定量分析。因此，固定免疫沉淀法在研究蛋白质表达水平、翻译后修饰及蛋白质稳定性时显得尤为重要。

本文将具体描述固定免疫沉淀法的实验操作步骤。针对所需的溶液与试剂，准备如下：

• PBS缓冲液
• 1×细胞裂解缓冲液：包含20mM Tris（pH 7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、25mM 焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4、1μg/ml 亮抑酶肽
• 3×SDS样品缓冲液：187.5mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C）、6% w/v SDS、30% 甘油、150mM DTT、0.03% w/v 溴酚蓝

注：以上溶液均需使用超纯水制备。使用前请在细胞裂解液中添加1mM PMSF。

1. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基，并根据实验需求添加含有调节因子的鲜培养基，处理细胞一段时间。
2. 去除培养基后，用冰预冷的PBS洗涤细胞一次。
3. 去除PBS后，每块细胞培养板（10 cm）添加0.5 ml预冷的1×细胞裂解缓冲液和1mM PMSF。
4. 在冰上孵育5分钟。
5. 轻轻刮下细胞，并转移至微量离心管，保存在冰上。
6. 在冰上对样品进行超声处理四次，每次5秒。
7. 在4°C下微量离心10分钟，收集上清液至新的试管中。
8. 若不立即进行后续实验，请将裂解物保存于-80°C。

2. 免疫沉淀法

1. 取200μl细胞裂解物，添加10μl固定抗体，置于摇床轻轻摇动，4°C孵育过夜。
2. 在4°C条件下微量离心30秒。
3. 用500μl的1×细胞裂解缓冲液重悬沉淀物进行清洗，重复该过程五次，洗涤期间样品保持于冰上。
4. 使用20μl的3×SDS样品缓冲液重悬沉淀物，涡旋混合后微量离心30秒。
5. 加热样品至95-100°C并保持2-5分钟。
6. 取15-30μl样品上样至SDS-PAGE凝胶，开展蛋白质印迹实验（具体步骤请参阅蛋白质免疫印迹法实验指南）。

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